María López de Mendoza y Pacheco nació en 1496 en el palacio del Partal, ubicado dentro de la fortaleza de la Alhambra. Pertenecía a dos de los linajes nobiliarios más importantes y de mayor protagonismo en la Castilla de ese momento. Su madre, Francisca, era hija de Juan Pacheco, marqués de Villena, y su padre, Íñigo, era miembro de la poderosa familia de los Mendoza y su protagonismo en la toma de Granada le sirvió para ganarse la confianza de los Reyes Católicos, que le nombraron alcaide de la Alhambra y de Granada, lo que explica el lugar de nacimiento de María, quien, como el resto de sus hermanos, recibió una cuidadosa formación, que le permitió tener un elevado conocimiento de lenguas clásicas, además de destacar en otros campos como la historia y las matemáticas.
Sus hermanos ocuparon puestos relevantes (marquesado, episcopado, virreinato…) y sus hermanas se casaron con miembros de destacadas familias aristocráticas y este era también el propósito que su padre tenía para ella, pues empezó a buscarle esposo cuando tan solo tenía doce años. Tras barajar varias opciones, su padre se decantó por un miembro de la pequeña nobleza castellana, Juan de Padilla, hijo del regidor y capitán de gentes de armas de Toledo y sobrino del comendador mayor de la Orden de Calatrava. Tras celebrarse el matrimonio en 1511, Juan y María se afincaron en Porcuna, donde pronto dieron muestras de su buena sintonía, a pesar de que su enlace hubiese sido pactado.
En 1518 marcharon a Toledo al suceder Juan a su padre como capitán de gentes de armas. Su cambio de residencia se produce en un momento convulso que condicionará el resto de sus vidas. La llegada de Carlos I a España en 1517 para asumir el gobierno de Castilla y Aragón (aunque, teóricamente, reinará en Castilla conjuntamente con su madre Juana) se produjo en un contexto de gran tensión, sobre todo en tierras castellanas, donde se extendió la sensación de que el joven rey, no solo desconocía el reino y su lengua, sino que no parecía muy interesado en los problemas que afectaban a Castilla. La situación se tornó aún más tensa cuando Carlos abandonó Castilla de forma repentina, dejando en los principales cargos políticos y eclesiásticos a personajes flamencos y estableciendo un aumento de impuestos para poder financiar su coronación como emperador.
Todo el malestar acumulado acabará provocando en 1520 el estallido en Castilla de la revuelta de las Comunidades, en la que Toledo tendrá un especial protagonismo. Carlos I marcha hacia Flandes el 20 de mayo de 1520 y pocos días después Toledo propuso crear una asamblea con las principales ciudades castellanas para poner orden en el reino. En julio de 1520 se constituyó la Santa Junta en Ávila y, aunque no todas las ciudades se unieron, pronto destacaron algunas como Toledo, Salamanca y Segovia, de donde procederán los principales líderes comuneros: Juan de Padilla, Francisco Maldonado y Juan Bravo, respectivamente.
Aunque tanto sus familiares paternos y maternos serán partidarios del rey Carlos, María apoyó en todo momento la causa comunera y respaldó la notable implicación de su marido. Mientras Juan de Padilla estuvo luchando por tierras castellanas liderando el bando comunero, María se hizo cargo del gobierno de Toledo. El 23 de abril de 1521 los comuneros eran derrotados definitivamente por las tropas realistas en la batalla de Villalar y sus tres líderes eran ajusticiados. Cuando María recibió la noticia su salud se resintió notablemente, pero lejos de abandonar, decidió abanderar la causa comunera, haciendo de Toledo el último bastión de la resistencia frente a Carlos I.
A pesar de encontrarse muy débil, se trasladó junto con su hijo al Alcázar toledano, desde donde dirigió la defensa de la ciudad, que será asediada por el ejército real. Durante seis meses resistirá los ataques de los partidarios de Carlos I y para ello no dudará en utilizar todos los medios a su alcance, llegando a vender sus joyas personales o a confiscar plata del sagrario de la catedral para pagar a las milicias toledanas. En octubre de 1521 se firmó una tregua que posibilitó una frágil convivencia en la ciudad entre comuneros y realistas. María regresó a su casa, aunque reforzó sus defensas. La frágil tregua se rompió el 3 de febrero de 1522, produciéndose graves disturbios en la ciudad. Por la noche, aprovechando cierta calma, la condesa de Monteagudo, hermana de María, la ayudó a escapar de Toledo disfrazada de aldeana y huyó hacia Portugal. En octubre de 1522 Carlos I decretó un perdón general para los comuneros, pero excluyó a María, que sería condenada a muerte en 1523, pena que no se pudo ejecutar porque el rey portugués se negó a entregar a la “última comunera” a Carlos I.
En marzo de 1531 moría en Oporto, tras haber expresado como última voluntad que quería que sus restos fueran enterrados en Villalar junto a los de su marido, deseo que no se pudo materializar por la negativa del rey. Aunque algunos cronistas de la época, partidarios del bando real, la acusaron de ambiciosa, incluso de emplear la brujería, muchos de sus contemporáneos la admiraron por haber luchado hasta el final por sus ideales, llegando a recibir el sobrenombre de “la leona de Castilla”.